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蛋白共提取试剂盒对于体外培养细胞的方法
点击次数:338 发布时间:2018-05-21
    蛋白共提取试剂盒是从培养细胞和动物组织样品同时抽提RNA和DNAzui为快速简单的方法。本试剂盒基于硅胶柱纯化技术,提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提,也无需进行耗时的醇类沉淀,整个过程只需35分钟。该方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 纯化,核酸保护和体外翻译等实验。
    1.根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF,使PMSF的zui终浓度为1mM。PMSF需现用现加,若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸,可以在两种蛋白抽提液中加入DTT至终浓度0.5mM。
    2.对于贴壁细胞,去除培养液,用PBS洗一遍,用细胞刮刀收集细胞,或用EDTA消化后吹打下细胞(zui好不用胰酶硝化,以免胰酶消化目的蛋白)。500g离心2~3分钟收集细胞,吸尽上清留下沉淀备用。
    3.对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,500g离心2~3分钟收集细胞,吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
    4.每20ul细胞沉淀加入200ul浆蛋白抽提试剂(2×106个细胞沉淀约20ul或40mg)。
    5.用移液器吹打或高速涡旋15秒(可适当延长),必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散不完全会导致蛋白产量降低。
    6.冰浴10分钟。
    7.zui高转速剧烈涡旋10秒,4℃12000~16000g离心10分钟。
    8.上清即为抽提得到的细胞浆蛋白,立即吸取上清至预冷的样品管中备用,进行后续的PAGE、Western等实验,但蛋白浓度较低,可根据需要进行相应浓缩。
    9.沉淀即为细胞核,要完全吸尽残余的上清(避免细胞浆蛋白的污染),加入50-100ul核蛋白抽提试剂。
    10.用移液器吹打或高速涡旋15秒(可适当延长)至沉淀完全分散,冰浴10分钟。
    11.zui高转速剧烈涡旋10秒,4℃12000~16000g离心10分钟。
    12.立即吸取上清至预冷的样品管中,此即为抽提得到的细胞核蛋白。可进行后续实验或-70℃冻存。 
电话:
021-60927620
手机:
15800446246
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