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磷酸化蛋白多重检测的方法分析
点击次数:129 发布时间:2018-06-26
蛋白质磷酸化由蛋白质激酶所催化,磷酸化多发生在多肽链丝氨酸,苏氨酸的羟基上,偶尔也发生在酪氨酸残基上,这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋白激酶催化,磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性,例如:促进糖原分解的磷酸化酶,无活性的磷酸化酶b经磷酸化以后,变成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D,共同调节糖原的合成与分解。以下简要介绍几种常用的磷酸化蛋白多重检测的方法。
1.westernblot
检测蛋白磷酸化状态的最常用方法是westernblot,过程是先用SDS-PAGE分离生物样品,接着转移到膜上,最后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Westernblot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。磷酸化特异抗体大多十分灵敏,可轻松检测常规样品中的磷酸化蛋白。
2.酶联免疫吸附分析(ELISA)
ELISA的定量能力比Westernblot更强,非常有助于研究激酶活性调节及其功能。这种微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特异的捕获抗体,和磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中,加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
3.激酶活性分析
蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分,它们影响了众多负责生物反应的下游效应物,因此,评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的,在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化,包括显色、放射性或荧光检测。
4.磷酸化特异抗体的开发
20世纪90年代,科学家利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子,开发出多个磷酸化状态特异抗体,这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中,产生高度特异的免疫试剂。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在任何技术中使用磷酸化特异抗体都要注意,成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。 
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